Drei Meeresarten der Gattung Fulvivirga, reiche Kohlenhydratquellen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6301 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bacteroidota ist eine Gruppe mariner Polysaccharidabbauer, die eine entscheidende Rolle im Kohlenstoffkreislauf der Meeresökosysteme spielen. In dieser Studie wurde vorgeschlagen, dass drei neuartige Gleitstämme, die als SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T bezeichnet werden und aus Algen und verrottendem Holz isoliert wurden, drei neue Arten der Gattung Fulvivirga repräsentieren. Basierend auf der Sequenzierung des gesamten Genoms haben wir eine große Anzahl von Genen identifiziert, die für kohlenhydrataktive Enzyme kodieren, die möglicherweise am Polysaccharidabbau beteiligt sind. Die Ähnlichkeiten der 16S-rRNA-Sequenzen zwischen ihnen betrugen 94,4–97,2 % und mit denen bestehender Arten der Gattung Fulvivirga 93,1–99,8 %. Die vollständigen Genome der Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T umfassten ein kreisförmiges Chromosom mit einer Größe von 6,98, 6,52 bzw. 6,39 MB; die GC-Gehalte betrugen 41,9 %, 39,0 % bzw. 38,1 %. Die durchschnittliche Nukleotididentität und die digitalen DNA-DNA-Hybridisierungswerte mit Mitgliedern der Gattung Fulvivirga einschließlich der Isolate lagen im Bereich von 68,9–85,4 % bzw. 17,1–29,7 %, was für den Vorschlag neuer Arten niedrig ist. Genomic Mining in drei Genomen identifizierte Hunderte von kohlenhydrataktiven Enzymen (CAZymes), die bis zu 93 CAZyme-Familien und 58–70 CAZyme-Gencluster abdecken und damit die Anzahl der in den anderen Arten der Gattung Fulvivirga vorhandenen Gene übertreffen. Polysaccharide von Alginat, Chitin, Laminarin, Stärke und Xylan wurden in vitro abgebaut, was unterstreicht, dass die drei Stämme reichhaltige Quellen für CAZymes von Polysaccharidabbauern für biotechnologische Anwendungen sind. Die phänotypischen, biochemischen, chemotaxonomischen und genomischen Merkmale unterstützten den Vorschlag von drei neuen Arten in der Gattung Fulvivirga, für die die Namen Fulvivirga ulvae sp. Nov. (SS9-22T = KCTC 82072T = GDMCC 1,2804T), Fulvivirga ligni sp. Nov. (W9P-11T = KCTC 72992T = GDMCC 1,2803T) und Fulvivirga maritima sp. Nov. (SW1-E11T = KCTC 72832T = GDMCC 1.2802T) werden vorgeschlagen.

Der Abbau mariner Polysaccharide durch heterotrophe Bakterien spielt eine wichtige Rolle im Kohlenstoffkreislauf1,2. Polysaccharide sind langkettige polymere Kohlenhydratmoleküle, die durch glykosidische Bindungen aufgebaut sind, die Monosaccharideinheiten verbinden3. In der Meeresumwelt sind Meeresalgen weltweit einer der Hauptproduzenten von Polysacchariden. Rote Algen wie Eucheuma sp.4 und Polyneura sp.5,6 enthalten Agar, Carrageenan, Mannan und Xylan. Grünalgen wie Chlamydomonas sp.7, Chlorella sp. und Ulva sp.8,9 enthalten Cellulose, sulfatierte Galactane, Ulvane und Xylan. Braunalgen wie Ascophyllum sp., Fucus sp.10 und Laminaria sp.11 enthalten Alginat, Fucoidan und Laminarin. Kieselalgen wie Tetraselmis sp.12 enthalten Arabinogalactan, fucosehaltige sulfatierte Polysaccharide, Mannan und Galacturonan13. In marinen Polysacchariden enthält das Glykan-Rückgrat normalerweise Substitutionen der Methylgruppe14, Pyruvat15 und Sulfat16, damit Meeresorganismen sich an die Meeresbedingungen anpassen können17,18. Heterotrophe Meeresbakterien verfügen über verschiedene Enzyme, um diese Polysaccharide durch Aufbrechen der glykosidischen Bindungen zu verdauen und die Verbindungen mit hohem Molekulargewicht in Verbindungen mit niedrigerem Molekulargewicht umzuwandeln19. Diese Produktion und der biologische Abbau von Polysacchariden gelten als kritischer Schritt des Kohlenstoffkreislaufs in Meeresökosystemen13,20,21. Andererseits haben Algen-Oligosaccharide viele potenzielle Anwendungen in funktionellen Lebensmitteln, Biomedizin und Kosmetik22 sowie in der Biokraftstoff- und Zellstoffindustrie23,24. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Laminarin und Laminarin-Oligosaccharide verschiedene biologische Aktivitäten haben, darunter antioxidative, antitumorale und präbiotische Wirkungen, und dass sie zum immunmodulatorischen Mechanismus beitragen25. Darüber hinaus haben Alginat und seine abgeleiteten Oligosaccharide ähnliche Wirkungen wie antimikrobielle, blutdrucksenkende, gerinnungshemmende und antidiabetische Wirkung26,27. Dementsprechend steigt die Nachfrage nach der Bioproduktion von Algen-Oligosacchariden. Daher ist es wichtig, neue Polysaccharid abbauende Mikroorganismen zu identifizieren.

Der Stamm Bacteroidota (ein heterotypisches Synonym für Bacteroidetes) enthält einzigartige Gene für den Polysaccharidabbau28. Diese einzigartige Maschinerie umfasst SusD, das die Polysaccharide einfängt. Anschließend werden extrazelluläre kohlenhydrataktive Enzyme (CAZymes) sezerniert, um die Polysaccharide in Oligosaccharide abzubauen, die über SusC-Transporter auf der Membran in das Periplasma importiert werden29,30. Im Periplasma bauen zuckerabbauende Enzyme die Oligosaccharide weiter zu Monosacchariden ab31. Anschließend transportieren spezielle Transporter diese Monosaccharide, damit sie in das Zytoplasma gelangen29,31,32. Die Regulatoren der Genexpression werden durch die Erkennung der abgebauten kleinen Moleküle betätigt, die Produkte des Polysaccharidabbaus sind33. Diese CAZyme, Transporter und Regulatoren werden eng durch die Region eines Chromosoms kodiert, die als Polysaccharide Utilization Loci (PUL) bekannt ist34. In der Meeresumwelt enthalten die Vertreter der Klasse Flavobacteriia des Stammes Bacteroidota, die als Abbauer mariner Polysaccharide35,36,37,38 bekannt sind, PULs mit einer hohen Anzahl an Sulfatasen36. Sulfatasen sind erforderlich, um die Sulfatester oder Sulfamate aus diesen sulfatierten Polysacchariden39 zu entfernen, die bei einer hohen Sulfatkonzentration in der Meeresumwelt einer Sulfatierung unterliegen. Allerdings haben nur wenige Studien über die Polysaccharidabbaukapazität der Klasse Cytophagia, insbesondere der Familie Fulvivirgaceae, berichtet.

Mitglieder der Gattung Fulvivirga, die zum Stamm Bacteroidota gehören, wurden in verschiedenen Bereichen der Meeresumwelt entdeckt40,41,42,43,44,45, ihre Fähigkeit, Polysaccharide abzubauen, ist jedoch nicht genau verstanden. Die erstmals von Nedashkovskaya et al. beschriebene Gattung Fulvivirga. (2007) gehört zur Familie der Fulvivirgaceae, der Ordnung Cytophagales und der Klasse Cytophagia. Mitglieder der Gattung Fulvivirga sind heterotrophe, gramnegative, nicht begeißelte, nicht sporenbildende, stäbchenförmige Zellen und teilen Menachinon 7 (MK-7) als wichtigstes respiratorisches Chinon. Zum Zeitpunkt des Schreibens besteht die Gattung aus sieben Arten, darunter F. kasyanovii40, F. imtechensis41, F. lutimaris43, F. aurantia44, F. lutea42, F. marina45 und F. sediminis45. Bisher wurde berichtet, dass Mitglieder dieser Gattung Stärke nur unter Polysacchariden abbauen40,42,43,44.

In dieser Studie haben wir drei Stämme isoliert, die Polysaccharide abbauen, und schlagen drei neue Arten der Gattung Fulvivirga mit den Typstämmen SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T vor, basierend auf einer vergleichenden und umfassenden Charakterisierung der Isolate mit den sieben andere Arten der Gattung Fulvivirga. Die vollständigen Gesamtgenomsequenzen der drei Stämme wurden bestimmt und das Repertoire an CAZymes und PULs analysiert. Die Fähigkeit der Isolate zum Polysaccharidabbau wurde in silico und in vitro untersucht. Das Vorhandensein zahlreicher CAZyme und die Fähigkeit, Polysaccharide abzubauen, weisen darauf hin, dass die drei neuen Stämme reichhaltige Quellen kohlenhydrataktiver Enzyme für den Abbau von Polysacchariden und potenzielle biotechnologische Anwendungen sind.

Der Stamm SS9-22T wurde aus einer Grünalge Ulva sp. isoliert. gesammelt im Ostmeer (Abb. 1A), und die Stämme W9P-11T und SW1-E11T wurden aus einer Braunalge und verrottendem Holz isoliert, die jeweils im Westmeer (Abb. 1B, C) bzw. in der Republik Korea gesammelt wurden . Reinkulturen der drei Isolate wurden durch Selektion der Gleitmotilität auf einem modifizierten VY/2-Medium (pro Liter, Bäckerhefe, 5,0 g; CaCl2·2H2O, 1,0 g; Vitamin B12, 0,5 mg, Agar, 15 g) hergestellt enthalten 60 % Meerwasser, gepuffert mit HEPES (0,6 g/L), pH 7,2, und die drei gereinigten Stämme wuchsen gut auf dem Marine-Agar (MA) (Abb. 1D, E, F). Alle Stämme hatten unregelmäßige Kolonien auf dem festen Medium. Die Farbe war bräunlichgelb für SS9-22T, orange für W9P-11T und blassgelb für Stamm SW1-E11T (Tabelle 1). Die Zellen der drei Stämme waren stäbchenförmig mit einer Länge von 2–5 µm und einer Breite von 0,25–3,0 µm (Abb. 1G, H, I und Tabelle 1).

Herkunft, Koloniemorphologie und Zellmorphologie von drei neuen Isolaten der Gattung Fulvivirga. (A, D, G): Stamm SS9-22T; (B, E, H) Stamm W9P-11T; (C, F, I) Stamm SW1-E11T. A: Algen, die in der Ostsee gesammelt wurden; B: am Gelben Meer gesammeltes zersetztes Holz; C: Algen, gesammelt am Gelben Meer; D, E, F: Koloniemorphologie der Stämme auf der MA-Platte; G, H, I: SEM-Bilder von Zellen neuartiger Stämme. Maßstabsbalken: 1 cm (A,B), 0,5 cm (C), 1 μm (G,H,I).

Um die taxonomische Position der Isolate zu bestimmen, wurden die 16S-rRNA-Gensequenzen bestimmt. Die Ausrichtung der drei 16S-rRNA-Sequenzen auf der EzBioCloud-Website (https://www.ezbiocloud.net/) ergab, dass der Stamm SS9-22T dem Stamm Fulvivirga kasyanovii KCTC 12832T mit einer Ähnlichkeit von 98,1 % am nächsten kam; Die Stämme W9P-11T und SW1-E11T hatten mit 94,9 % bzw. 99,8 % die größte Ähnlichkeit mit F. sediminis 2943T (Tabelle S1). Die 16S-rRNA-Sequenzen von SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T wurden als OM403091, OM403093 bzw. OM403092 bei GenBank registriert.

Eine phylogenetische Analyse basierend auf 16S-rRNA-Gensequenzen zeigte, dass alle drei Isolate zu einer monophyletischen Gruppe der Gattung Fulvivirga gehörten. Die Clusterbildung wurde durch hohe Bootstrap-Werte von 93 % bzw. 95 % bei Maximum-Likelihood- und Neighbor-Joining-Algorithmen unterstützt (Abb. 2). Interessanterweise bildete innerhalb der Gruppe der Gattung Fulvivirga der Stamm SS9-22T einen separaten Cluster mit dem Stamm F. Marina 29W222T; aber zwei Stämme, SW1-E11T und W9P-11T, bildeten einen monophyletischen Cluster mit Stamm F. sediminis 2943T, der vom Stamm SS9-22T getrennt wurde. Darüber hinaus lagen die Ähnlichkeitswerte des 16S-rRNA-Gens zwischen den drei Isolaten unter 98,1 % (Tabelle S1) und die Ähnlichkeitswerte zwischen den Isolaten und den vorhandenen sieben Arten lagen unter 98,1 %, mit Ausnahme des Ähnlichkeitswerts von 99,8 % zwischen Stamm SW1 -E11T mit F. sediminis 2943T. Um die genaue phylogenetische Position der drei Stämme zu bestimmen, wurden eine polyphasische Taxonomie und eine Genomanalyse durchgeführt.

Mit der MEGA7-Software (Version 7.0.26) erstellter phylogenetischer Maximum-Likelihood-Baum basierend auf 16S-rRNA-Sequenzen, der die Positionen der drei neuen Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T zeigt, wobei ihre nächsten Vertreter zur Ordnung Cytophagales gehören. Als Fremdgruppe wurde der Stamm Flavobacterium aquatile NBRC 15052T (GenBank-Zugangsnummer AB517711) verwendet. Die GenBank-Zugangsnummern sind in Klammern angegeben. Die 16S-rRNA-Sequenzen wurden von ClustalW ausgerichtet und das Ergebnis wurde in der BioEdit-Software (Version 7.2.5) zugeschnitten. Zur Bewertung des phylogenetischen Baums wurde die Bootstrap-Resampling-Methode von 1000 Replikaten angewendet. Bootstrap-Werte > 50 % werden angezeigt. Die geschlossenen Kreise stehen für den Konsens der wiederhergestellten Knoten unter Verwendung der drei Algorithmen ML, NJ bzw. MP. Die leeren Kreise stehen für den Konsens der wiederhergestellten Knoten, die von zwei von drei Algorithmen gefunden wurden. Balken, 0,025 Substitutionen pro Nukleotidposition.

Bei allen drei Isolaten handelte es sich um gramnegative, stäbchenförmige, mesophile Bakterien, die mit den bestehenden Arten der Gattung Fulvivirga gemeinsam sind. Andererseits unterschieden sich zwei Stämme, W9P-11T und SW1-E11T, von den anderen Arten der Gattung Fulvivirga dadurch, dass sie Pigmente vom Flexirubin-Typ enthielten. Die Koloniemorphologien der drei neuen Stämme waren unregelmäßig, die der anderen Arten jedoch kreisförmig. Auch die Koloniefarben unterschieden sich von denen anderer Arten der Gattung Fulvivirga (Tabelle 1, Abb. 1 und Abb. S1). Der Stamm SW1-E11T wuchs langsam unter anaeroben oder mikroaerophilen Bedingungen, was F. sediminis 2943T 45 und F. marina 29W222T 45 ähnelt, während die beiden anderen neuartigen Isolate und die übrigen Arten ausschließlich unter aeroben Bedingungen wuchsen40,41,42,43 ,44. Darüber hinaus zeigten die drei Isolate eine Gleitmotilität, die sich von F. lutimaris KCTC 42720T 43 und F. imtechensis JCM 17390T 41 unterschied. Interessanterweise weisen die Stämme SW1-E11T und F. sediminis 2943T eine hohe Ähnlichkeit des 16S-rRNA-Gens auf (99,8 %). ) wiesen ihre phänotypischen Merkmale mehrere Unterschiede auf. Erstens hatte die Kolonie des Stamms SW1-E11T eine glatte und glänzende Oberfläche, während die Kolonie von F. sediminis 2943T eine raue und trockene Oberfläche hatte (Abb. S1). Zweitens enthielt der Stamm SW1-E11T Pigmente vom Flexirubin-Typ, F. sediminis 2943T jedoch nicht (in dieser Studie getestet). Die detaillierten Merkmale der drei Isolate und der vorhandenen Arten der Gattung Fulvivirga sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die biochemischen Merkmale der drei neuen Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T hatten gemeinsame Merkmale, wie Stärkeabbau, Oxidase- und Katalaseaktivität sowie die Verwendung von D-Cellobiose, Dextrin, Gentiobiose, D-Glucose, D -Melibiose, D-Raffinose, D-Trehalose und D-Turanose mit den vorhandenen Arten der Gattung Fulvivirga. Interessanterweise war nur der Stamm W9P-11T positiv für die D-Glucuronsäure-Verwertung und nur die Stämme SS9-22T und W9P-11T nutzten L-Serin. Darüber hinaus zeigten nur die Stämme SW1-E11T und F. lutimaris KCTC 42720T N-Acetyl-β-Glucosaminidase-Aktivität. Alle drei neuen Stämme konnten Tweens 20 und 40 hydrolysieren, im Gegensatz zu F. aurantia KCTC 82638T und F. lutimaris KCTC 42720T. Ein Kaseinabbau wurde in den Stämmen SS9-22T und W9P-11T festgestellt, nicht jedoch im Stamm SW1-E11T. Chitinabbau wurde in den Stämmen SS9-22T, SW1-E11T, F. imtechensis JCM 17390T und F. kasyanovii KCTC 12832T beobachtet, nicht jedoch in den Stämmen W9P-11T, F. aurantia KCTC 82638T und F. lutimaris KCTC 42720T. Die Stämme SW1-E11T und F. sediminis 2943T wiesen mehrere Unterschiede in den biochemischen Eigenschaften auf. Der Stamm SW1-E11T war positiv für DNase-, β-Galactosidase- und β-Glucosidase-Aktivitäten und zeigte die Fähigkeit, N-Acetyl-D-glucosamin, Glycyl-L-prolin, Melibiose, Pektin, D-Raffinose, Natriumbutyrat, D-Trehalose, D-Turanose und Stachyose, während F. sediminis 2943T nicht alle davon verwerten kann45. Detailliertere Unterschiede zur Unterscheidung der drei neuen Stämme von den anderen Arten sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die Hauptfettsäuren (> 5,0 %) der drei neuen Isolate waren iso-C15:0, iso-C17:0 3-OH, C16:1 ω5c, summiertes Merkmal 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c), und iso-C15:0 3-OH. Bemerkenswert ist, dass der Stamm SS9-22T 7,6 % Iso-C15:1 G enthielt, was F. aurantia KCTC 82638T, F. Marina 29W222T und F. lutimaris KCTC 42720T ähnelt; Diese Komponente war in den Stämmen W9P-11T (2,4 %), SW1-E11T (2,8 %), F. sediminis 2943T (2,3 %) bzw. F. imtechensis JCM 17390T (3,7 %) niedriger. Darüber hinaus war das summierte Merkmal 3 in den Stämmen W9P-11T und SW1-E11T sowie in F. sediminis 2943T höher als 10 % als im Stamm SS9-22T und den übrigen Referenzstämmen (Tabelle 3). Zusammen mit der phylogenetischen Baumtopologie (Abb. 2) konnte die Klade, bestehend aus zwei neuen Isolaten W9P-11T und SW1-E11T und zwei anerkannten Arten F. sediminis 2943T und F. imtechensis JCM 17390T, vom Rest der Arten unterschieden werden bestehend aus einem unterschiedlichen Prozentsatz an Fettsäurekomponenten des summierten Merkmals 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c) und iso-C15:1 G (Tabelle 3).

Die polaren Lipidprofile der drei Isolate ähnelten denen der gültig veröffentlichten Arten der Gattung Fulvivirga. Der Stamm SS9-22T enthielt drei Aminophospholipide, vier nicht identifizierte Lipide, ein nicht identifiziertes Aminolipid, ein nicht identifiziertes Phospholipid und ein nicht identifiziertes Glykolipid. Stamm W9P-11T enthielt Phosphatidylethanolamin (PE), drei nicht identifizierte Lipide, fünf nicht identifizierte Aminolipide, zwei nicht identifizierte Phospholipide und drei nicht identifizierte Aminophospholipide. Unterdessen enthielt der Stamm SW1-E11T Phosphatidylethanolamin, drei Aminophospholipide, vier nicht identifizierte Lipide, ein nicht identifiziertes Aminolipid und ein nicht identifiziertes Phospholipid. Interessanterweise enthält F. sediminis 2943T kein Phospholipid im polaren Lipidprofil45, das sich vom neuen Stamm SW1-E11T unterschied (Abb. S2).

Die vollständigen Genome der Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T wurden durch eine Kombination der Sequenzierungsplattformen Nanopore und Illumina bestimmt. Jeder der drei Stämme enthielt ein einzelnes kreisförmiges Chromosom mit einer Größe von 6,98, 6,52 bzw. 6,39 MB. Der G + C-Gehalt der neuen Stämme lag zwischen 38,1 % und 41,9 %, ähnlich dem Bereich bestehender Arten von 37,3 % bis 42,7 % (Tabelle 4). Die CheckM-Analyse ergab, dass die drei zusammengestellten Genome eine hohe Vollständigkeit und eine geringe Kontamination aufweisen (Tabelle 4), was auf die hohe Qualität und Zuverlässigkeit der durch die Kombination zweier Sequenzierungsmethoden zusammengestellten Genome hinweist. Ein Vergleich der genomischen Eigenschaften der drei Isolate mit bekannten Mitgliedern der Gattung Fulvivirga ist in Tabelle 4 dargestellt. Da alle zusammengesetzten Genome der Gattung Fulvivirga eine hohe Vollständigkeit (> 98 %) aufweisen, konnten wir detaillierte genomische Analysen und Vergleiche durchführen.

Um zu überprüfen, ob sich die Genome der Isolate taxonomisch unterscheiden, wurden die durchschnittlichen Werte der Nukleotididentität (ANI) und der digitalen DNA-DNA-Hybridisierung (dDDH) berechnet. Die ANI- und dDDH-Werte zwischen den drei Isolaten und den vorhandenen Arten der Gattung Fulvivirga (Tabelle 5) lagen in Bereichen von 69,1 % bis 85,4 % bzw. 17,1 % bis 29,7 %, was deutlich unter den Grenzwerten lag von 95–96 % für den ANI-Wert46 und 70 % für den dDDH-Wert47 zur Unterscheidung von Bakterienarten. Obwohl die 16S-rRNA-Genähnlichkeit der Stämme SW1-E11T und F. sediminis 2943T 99,8 % betrug, lagen die ANI- und dDDH-Werte interessanterweise bei 84,34 % bzw. 27,4 %, was unter den Grenzwerten zur Unterscheidung zweier Arten lag. Der genombasierte phylogenetische Baum (Abb. 3) zeigte konsistent nicht nur die phylogenetische Position der drei neuen Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T innerhalb des Clusters der Gattung Fulvivirga, wie im 16S-rRNA-basierten Stammbaum (Abb. 2), sondern auch die Trennung der Isolate von den vorhandenen Arten, wie die niedrigeren ANI- und dDDH-Werte zeigten. Daher ergab die Differenzierung auf der Grundlage einer Analyse des gesamten Genoms, dass die drei Isolate drei neue Arten der Gattung Fulvivirga darstellen.

Phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit, der die Beziehung zwischen eng verwandten SS9-22T-, W9P-11T- und SW1-E11T-Arten zeigt, basierend auf 92 Kerngenen, die mithilfe der UBCG-Pipeline identifiziert wurden. Die GenBank-Zugangsnummern der gesamten Genomsequenzen sind in Klammern angegeben. Flavobacterium aquatile ATCC 11947T (GCF_002217235) als Fremdgruppe. An den Zweigknoten werden Bootstrap-Werte angezeigt, die auf 1000 Replikaten basieren. Bar, 0,1 Auswechslungen pro Standort.

Die Genomanalyse ergab, dass drei Stämme eine Reihe von Genen zur Produktion bioaktiver Verbindungen und eine große Anzahl kohlenhydrataktiver Enzyme enthalten. Die antiSMASH48-Analyse sagte mehrere Gene voraus, die für Polyketide und nicht-ribosomale Peptidsynthetase im Genom der Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T kodieren. Es wird erwartet, dass fast alle Mitglieder der Gattung Fulvivirga eine große Anzahl bioaktiver Sekundärmetaboliten (15–26 biosynthetische Gencluster (BGCs)) produzieren, mit Ausnahme von F. aurantia KCTC 82638T, F. marina 29W222T und F. lutea S481T ( 2–4 BGCs) (Tabelle S2). In allen drei Isolaten war eine große Anzahl von Genen in den Cluster orthologe Gruppen (COGs) für Aminosäuretransport und -metabolismus verteilt, gefolgt von Translation, ribosomaler Struktur und Biogenese sowie Zellwand-/Membran-/Hüllenbiogenese (Abb. S3). . Gene, die an der Kohlenhydratverwertung beteiligt sind, wurden anhand der CAZy-Datenbank (http://www.cazy.org/)49 identifiziert, die Informationen über Glykosidhydrolasen (GHs, hydrolysieren glykosidische Bindungen), Glykosyltransferasen (GTs, bilden glykosidische Bindungen) und Polysaccharide bereitstellt Lyasen (PLs, spalten glykosidische Bindungen durch einen Eliminasemechanismus), Kohlenhydratesterasen (CEs, hydrolysieren Esterbindungen) und Hilfsaktivitäten (AAs, Redoxenzyme, die mit anderen CAZymen zusammenwirken). Das Genom des Stammes SS9-22T enthielt insgesamt 325 CAZy-Module, in denen 112 Gene für durch Kohlenhydrate abgebaute Proteine ​​kodierten. Das Genom des Stammes W9P-11T enthielt insgesamt 354 CAZy-Module, in denen 187 annotierte Gene mit dem Kohlenhydratabbau in Zusammenhang standen, also GHs, PLs und CEs. Mittlerweile kodierte das Genom des Stamms SW1-E11T insgesamt 260 CAZy-Module, in denen 138 Gene Proteine ​​kodierten, die mit GHs, PLs und CEs verwandt sind (Tabelle 6). Das vollständige Genom von F. lutea S481T wurde bestimmt, und deshalb verglichen wir das Genom von F. lutea S481T mit denen der drei Isolate, um mithilfe der CAZy-Datenbank auf die Fähigkeiten zum Kohlenhydratabbau zuzugreifen. Tatsächlich beträgt die Anzahl der CAZy-Module von F. lutea S481T ein Drittel der der drei Isolate. Über den dbCAN-Server50 konnten wir die Anzahl der CAZy-Module aus den unvollständigen Genomen der anderen Mitglieder der Gattung Fulvivirga zählen (Tabelle S3). Die GH-Anzahl der drei neuen Isolate war etwas niedriger als die Anzahl der in der CAZy-Datenbank annotierten Gene. Das Genom der drei neuen Stämme kodierte eine deutlich höhere Anzahl an GHs als das von F. aurantia KCTC 82638T, F. imtechensis JCM 17390T, F. kasyanovii KCTC 12832T, F. lutea S481T und F. lutimaris KCTC 42720T (Tabelle S3). . Die Genome der Stämme W9P-11T und SW1-E11T wiesen im Vergleich zu den anderen Arten der Gattung Fulvivirga (Tabelle S3) eine höhere Häufigkeit von GHs auf (24,5 bzw. 17,4 GHs pro Mb), mit Ausnahme von F. sediminis 2943T (21,79 GHs). pro Mb) und auch höher als die mittlere Häufigkeit von GHs (12 GHs pro Mb) in der marinen Bacteroidota51. Interessanterweise war das Vorkommen von CAZymes, die in den Genomen der drei neuen Stämme kodiert wurden, 1,4- bis 3,5-fach höher als in den Genomen der anderen Mitglieder der Klasse Flavobacteriia (Formosa agariphila KMM 3901T, 19337; Gramella flava JLT2011, 18451; und Polaribacter spp., 100–14638,52), die als Polysaccharidabbauer bekannt sind.

Die Gene für den Polysaccharidabbau wurden über die Server dbCAN50 und PULDB53 auf CAZy49 identifiziert. Über den dbCAN-Server wurden die CAZyme-Gencluster (CGCs)54, die eine ähnliche Genanordnung wie in PUL aufweisen, bei allen Mitgliedern der Gattung Fulvivirga gefunden (Tabelle S3). Die Genome der Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T enthielten 58–70 CGCs, die doppelt so groß waren wie die von F. aurantia KCTC 82638T, F. lutea S481T, F. lutimaris KCTC 42720T; Die Anzahl der im Genom des Stamms SS9-22T kodierten CGCs (58 CGCs) war ähnlich der Anzahl in F. imtechensis JCM 17390T und F. kasyanovii KCTC 12832T (Tabelle S3). Mithilfe von PULDB wurden die Polysaccharid-Utilization-Loci (PULs) aus den vollständigen Sequenzen der Stämme SS9-22T, W9P-11T, SW1-E11T und F. lutea S481T gefunden; Die PUL-Zahlen betrugen 24, 41, 32 bzw. 4 (Tabelle S3). Die Verteilung von CAZymes in PULs war bei den neuen Isolaten und dem Stamm F. lutea S481T unterschiedlich. Tatsächlich weist der Stamm F. lutea S481T nur vier mutmaßliche Proteine ​​auf, die mit dem Kohlenhydratabbau in PULs in Zusammenhang stehen, während diese Zahlen in den PULs der Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T jeweils 54, 143 und 47 betrugen. Dies zeigte, dass die neuen Isolate möglicherweise ein höheres Potenzial für den Abbau von Polysacchariden haben als bekannte Mitglieder der Gattung Fulvivirga. Interessanterweise enthielten die PULs des Stammes W9P-11T eine große Anzahl an kohlenhydratbindenden Modulen (CBMs), verteilt auf dreizehn PULs. CBMs fördern die katalytische Aktivität des CAZyme, indem sie das Enzym bei der Bindung an das Zielsubstrat, insbesondere unlösliche Polysaccharide, unterstützen und so den Abstand zwischen Enzym und Substrat verringern55. Das Vorhandensein einer hohen Anzahl von CBMs weist darauf hin, dass der Stamm W9P-11T das unlösliche Polysaccharid in der Meeresumwelt effektiv abbauen könnte. Darüber hinaus weist das Vorhandensein mehrerer Sulfatasen (zwei Gene aus SS9-22T; ein Gen aus Stamm W9P-11T) in den PULs der drei neuen Stämme darauf hin, dass diese PULs die sulfatierten Polysaccharide abbauen könnten. Durch die PULDB konnten die mutmaßlichen PUL-Substrate vorhergesagt werden. Im Genom des Stammes W9P-11T beherbergte PUL 10 das Doppeltandem-Gen susC/susD, gefolgt von der verschachtelten Anwesenheit von fünf GH43 und zwei GH51, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Arabinan hydrolysieren56. Darüber hinaus kodierte PUL 21 im Genom des Stamms SS9-22T die Tandem-susC/susD-Gene in der Nähe von zwei GH16- und GH3-Genen. Dies war ähnlich wie PUL 139 und 142 von Gillisia spp. Hel1_29, Hel1_33_143 und PUL 173 von Gramella sp. MAR_2010_147 wird voraussichtlich Laminarin verwenden52. Interessanterweise produzierte der Stamm SS9-22T in einer Brühenkultur aktive Laminarin-abbauende Enzyme (Tabelle 7). Unterdessen enthielten PUL 18 und PUL 23 des Stamms W9P-11T reichlich GH43, GH2 und GH92, von denen vorhergesagt wurde, dass sie mannosereiche Substrate hydrolysieren, ähnlich wie PUL 340 von Salegentibacter sp. Hel1_652. Darüber hinaus deutete die Häufigkeit von CBM6, CBM13, CBM32 und CBM88 in diesen PULs auf eine Verbesserung der katalytischen Aktivität durch einen engeren Kontakt der GH-Enzyme mit den Substraten hin55. Ähnlich wie der Stamm W9P-11T enthielt PUL 2 im Genom des Stamms SW1-E11T auch Tandem-susC/susD-Gene in der Nähe von zwei GH51- und drei GH43-Genen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Arabinan56 abbauen. PUL 18 der Stämme SS9-22T, PUL 20 und PUL 38 des Stamms W9P-11T, PUL 23 des Stamms SW1-E11T und PUL 2 des Stamms F. lutea S481T enthielten GH13, und es wird vorhergesagt, dass GH13 an der Hydrolyse von beteiligt ist Stärke29. Das Vorhandensein der PULs der Stärkeverwertung stimmte mit der Beobachtung überein, dass die drei neuen Stämme und die Stämme des bestehenden Typs alle in vitro Stärkeabbauaktivität zeigten.

Die extrazellulären Enzymaktivitäten für den Abbau von Alginat, κ-Carrageenan, Cellulose, Chitin, Fucoidan, Laminarin, Stärke und Xylan wurden durch den Nachweis eines reduzierten Zuckers durch den 3,5-Dinitrosalicylsäure-Assay getestet. Alle drei Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T konnten Stärke und Xylan abbauen (Tabelle 7). Der Stärkeabbau wurde durch die Feststellung gestützt, dass alle drei Stämme eine hohe Anzahl an GH13 enthalten, das hauptsächlich für α-Amylase57,58 und GH57 verantwortlich ist (Tabelle S4). Darüber hinaus enthielten die Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T auch zahlreiche Xylanase-Gene der Familien GH359, GH560, GH1060 und GH3060,61 (Tabelle S4). Interessanterweise konnte der Stamm SS9-22T Laminarin abbauen, und das Genom des Stammes enthielt PUL 21, das hinsichtlich der Genorganisation dem Laminarin-spezifischen PUL von Gramella forsetii KT0803T sehr ähnlich ist62. Dies deutete darauf hin, dass die Untersuchung der Genkonstruktion in PULs das Kandidatensubstrat vorhersagen könnte. Nur der Stamm SS9-22T unter den drei Isolaten konnte Alginat abbauen, und nur der Stamm W9P-11T unter den drei Isolaten konnte Chitin abbauen. Das Genom des Stammes SS9-22T hatte einen PL6 und drei PL7, die für den Alginatabbau verantwortlich sind26. Das Genom des Stammes W9P-11T enthielt elf GH3, zehn GH5, vier GH18, zwei GH20, drei GH23 und ein GH48, von denen bekannt ist, dass sie alle am Chitinabbau beteiligt sind63,64. Der Nachweis der Polysaccharid-Abbauaktivitäten und das Vorhandensein entsprechender Gene weisen darauf hin, dass die drei neuen Stämme Polysaccharid-abbauende Enzyme produzieren könnten.

Aus der Kombination genombasierter und experimenteller Analysen zum Polysaccharidabbau zeigten die Mitglieder der Gattung Fulvivirga die Merkmale der Anpassung und Spezialisierung beim Polysaccharidabbau durch den Beitrag von CAZyme37,65. Tatsächlich wurden die Stämme aus Algen, verrottendem Holz und Sedimenten isoliert, darunter F. ulvae SS9-22T, F. maritima SW1-E11T, F. ligni W9P-11T, F. sediminis 2943T, F. marina 29W222T und F. lutimaris KCTC 42720T enthielt eine große Anzahl an CAZy-Modulen, die mehr als 2,60 % der gesamten Gene entsprachen (Tabelle S3). Der aus Meerwasser isolierte Stamm F. aurantia KCTC 82638T enthielt inzwischen eine geringe Anzahl von CAZy-Modulen von 55 Genen, was nur 1,37 % der Gene insgesamt ausmacht. Darüber hinaus zeigte ein In-vitro-Test in dieser Studie, dass die Stämme SS9-22T und SW1-E11T in der Lage waren, Alginat, Chitin, Laminarin, Stärke und Xylan, bei denen es sich um algenassoziierte Polysaccharide handelt, durch die entsprechenden CAZyme abzubauen (Tabelle 7). Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die Mitglieder der Gattung Fulvivirga über eine hohe Fähigkeit verfügen, marine Polysaccharide abzubauen, und insbesondere die drei neuen Isolate zeigten in dieser Hinsicht ein deutlich höheres Potenzial als die bekannten Arten.

Durch einen mehrphasigen Ansatz präsentierte diese Studie die drei neuen Arten der Gattung Fulvivirga des Stammes Bacteroidota als reichhaltige Quellen für kohlenhydrataktive Enzyme und auch als potenzielle Polysaccharidabbauer. Durch die Isolierungsmethode, die natürliche Bedingungen nachahmt, wurden die Typusstämme der drei neuen Arten rein isoliert. Die Analyse der Genomen und ein Polysaccharidabbautest der drei neuen Arten trugen dazu bei, die potenzielle Bioproduktion der drei neuen Arten aufzudecken und lieferten Informationen und eine Strategie für die weitere Untersuchung aktiver Enzyme, die marine Polysaccharide hydrolysieren.

Fulvivirga ulvae (ul'vae. L. gen. n. ulvae von Ulva, der Name der Algenart, aus der isoliert wird).

Zellen sind gramnegativ, mesophil, neutrophil und stäbchenförmig. Sie sind streng aerob und Katalase- und Oxidase-positiv. Kolonien auf MB-Agar sind unregelmäßig und glänzend, bilden im zentralen Bereich einen Klumpen und haben eine gelbe bis bräunliche Farbe. Das Wachstum erfolgt bei 10–45 °C (optimal, 37 °C), bei pH 6,0–8,0 (optimal, pH 7,0) und mit 0,5–15 % NaCl (optimal, 2 %). Es entsteht H2S. Positiv für die Hydrolyse von Kasein, Gelatine, Tweens 20, 40 und den Abbau von Alginat, Laminarin, Stärke und Xylan. Negativ für Pigmente vom Flexirubin-Typ. Negativ für die Hydrolyse von Tween 80. Die Hauptfettsäurekomponenten sind Iso-C15:0, Iso-C17:0 3-OH und C16:1 ω5c.

Der Typstamm SS9-22T (= KCTC 82072T = GDMCC 1.2804T) wurde aus der Grünalge Ulva sp. isoliert. Das Genom enthält ein kreisförmiges Chromosom mit einer Länge von 6,98 MB. Der G + C-Gehalt beträgt 41,85 %, berechnet aus der Gesamtgenomsequenzierung.

Fulvivirga ligni (ligni. L. gen. n. ligni, aus Holz, bezogen auf die Isolationsquelle).

Zellen sind gramnegativ, mesophil, neutrophil und stäbchenförmig. Sie sind streng aerob und Katalase- und Oxidase-positiv. Kolonien auf MB-Agar sind unregelmäßig, glänzend und orange. Das Wachstum erfolgt bei 10–37 °C (optimal, 30 °C), bei pH 5,5–8,0 (optimal, pH 6,0–7,0) und mit 0,5–12 % NaCl (optimal, 1–2 %). Es entsteht H2S. Positiv für die Hydrolyse von Kasein, Chitin, Gelatine, Tweens 20 und 40 sowie den Abbau von Stärke und Xylan. Positiv für die Pigmentproduktion vom Flexirubin-Typ. Negativ für die Hydrolyse von Tween 80. Die Hauptfettsäurekomponenten sind iso-C15:0, iso-C17:0 3-OH, C16:1 ω7c/C16:1 ω6c und C16:1 ω5c.

Der Typstamm W9P-11T (= KCTC 72992T = GDMCC 1.2803T) wurde aus einem degradierten Holz isoliert. Das Genom enthält ein kreisförmiges Chromosom mit einer Länge von 6,52 MB. Der G + C-Gehalt beträgt 38,95 %, berechnet aus der Gesamtgenomsequenzierung.

Fulvivirga maritima (ma.ri'ti.ma. L. fem. adj. maritima der Meeresumwelt, maritim, bezieht sich auf den Lebensraum der Isolation).

Die Zellen sind gramnegativ, mesophil, neutrophil und stäbchenförmig. Sie sind positiv für mikroaerophile, Katalase- und Oxidase-Aktivitäten. Kolonien auf MB-Agar sind unregelmäßig, hellgelb, glatt und in der Mitte der Kolonien dunkelgelb. Das Wachstum erfolgt bei 10–37 °C (optimal, 30 °C), bei pH 6,0–8,0 (optimal, pH 7,0) und mit 0,5–12 % NaCl (optimal, 2 %). Es entsteht H2S. Positiv für die Hydrolyse von Gelatine und Tweens 20, 40 und 80 sowie den Abbau von Laminarin, Stärke und Xylan. Negativ für die Hydrolyse von Kasein. Positiv für die Pigmentproduktion vom Flexirubin-Typ. Die Hauptkomponenten der Fettsäurezusammensetzung sind Iso-C15:0, Iso-C17:0 3-OH, Summenmerkmal 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c) und C16:1 ω5c.

Der Typstamm SW1-E11T (= KCTC 72832T = GDMCC 1.2802T) wurde aus einer dunkelgrünen Meeresalge isoliert. Das Genom enthält ein kreisförmiges Chromosom mit einer Länge von 6,39 MB. Der G + C-Gehalt beträgt 38,14 %, berechnet aus der Gesamtgenomsequenzierung.

Algen und zersetztes Holz wurden im Nordpazifik in dem zur Republik Korea gehörenden Gebiet gesammelt. Die braunen Algen und das zersetzte Holz wurden am 14. Oktober 2019 in Dongho-ri, Hae-myeon, Gochang-gun, Provinz Jeollabuk (Westsee) (35°31′01,6″ N, 126°28′57,4″ E) gesammelt. . Die Grünalge Ulva sp. wurde am 15. Januar 2020 im Hafen Sodol, Jumunjin, Provinz Gangwon (Ostsee) (37°54′16,9″ N, 128°49′48,2″ E) gesammelt. Bei der Isolierungsmethode wurde die Strategie angewendet, die natürlichen Bedingungen der Bakterien nachzuahmen. Tatsächlich wurde das Isolationsmedium auf Basis von 60 %igem Meerwasser (an der Probenahmestelle gesammelt) hergestellt, mit 1,5 % (Gew./Vol.) Agar (BD) versetzt und anschließend mit 50 mg/L filtriertem Sterilisationscycloheximid (Aldrich Sigma) injiziert Autoklavieren des Mediums. Zusätzlich wurde ein Stück Filterpapier (1 cm2, Whatman Nr. 2) als Träger für die Probe auf die Oberfläche der Isolationsagarplatte gelegt. Anschließend wurde ein Stück jeder Probe auf die Oberfläche des Filterpapiers gelegt und bei 28 °C unter aeroben Bedingungen beimpft. Anschließend wurde das Signal der auf der Agaroberfläche erscheinenden gleitenden Bakterien unter einem Stereomikroskop (ZEISS Stemi 508) beobachtet und die gleitenden Bakterienzellen mit einer scharfen Nadel (Innendurchmesser 0,26 mm) aufgenommen und in ein Nährmedium übertragen 60 % Meerwasser-gepuffertes VY/2-Medium (in 1 L: 600 ml Meerwasser, 5 g Bäckerhefe (Aldrich Sigma), 15 g Agar, 400 ml destilliertes Wasser, pH 7,0 ± 0,2, eingestellt durch 1 M NaOH, 25 mg filtriertes-sterilisiertes Vitamin B12). Das mit 60 % Meerwasser gepufferte VY/2-Medium unterstützt die Gleitmotilität der Zielbakterien66. Im Nährmedium wurde nach drei bis fünf Tagen Inkubationszeit der Rand der gleitenden Zellen aufgenommen und die Zellen auf das frische Medium einer mit 60 % Meerwasser gepufferten VY/2-Agarplatte übertragen, bis die Reinkultur erhalten wurde. Alle Reinkulturen wurden in 20 % Glycerin bei -80 °C und einer lyophilisierten Ampulle bei 4 °C konserviert. Reinkulturen der drei neuartigen Stämme wurden bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC) und dem Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) hinterlegt.

Um die drei neuen Isolate zu identifizieren, wurden ihre 16S-rRNA-Gene auf Basis der vier universellen Primer 27F67, 518F68, 805R69 und 1492R67 amplifiziert und mit der Sanger-Methode sequenziert. Die vollständigen Sequenzen wurden manuell mithilfe der NTI-Vektorsoftware70 zusammengestellt. Das paarweise Sequenz-Alignment der Sequenzen wurde auf EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/) durchgeführt. Die BioEdit-Software (Version 7.2.5)71 wurde für ClustalW-Mehrfachausrichtungen und das Trimmen der Ergebnisse verwendet. Die gekürzte Datei wurde verwendet, um phylogenetische Bäume basierend auf drei Algorithmen in der MEGA7-Software72 zu erstellen, bestehend aus Neighbor-Joining (NJ)73, Maximum-Likelihood (ML)74 und Maximum-Parsimony (MP)75. Das optimale Modell für den MP-Baum war das Kimura-2-Parameter-Modell, und die Raten und Muster waren Gamma-verteilt mit invarianten Stellen (G + I), während das Kimura-Zwei-Parameter-Modell76 für NJ und Baumhalbierungs-Wiederverbindung verwendet wurde (TBR) wurde für den ML-Algorithmus verwendet. Die paarweise Ausrichtung zwischen den drei neuen Stämmen wurde nach dem Trimmen mit der Software BioEdit (Version 7.2.5)71 berechnet.

Die physiologischen Eigenschaften aller drei Stämme wurden bestimmt. Alle Experimente wurden dupliziert. Die Morphologie der Kolonien wurde nach dreitägiger Kultivierung unter aeroben Bedingungen auf Marine-Agar-Platten (MA) beobachtet. Die Gram-Färbung wurde gemäß dem Standardprotokoll77 durchgeführt und die Ergebnisse unter einem Lichtmikroskop (Nikon Eclipse 80i) beobachtet. Die Zellmorphologie wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM, JEOL JSM 7600F)78 beobachtet. Die Wachstumstemperatur wurde in Meeresbrühe (MB) für 7 Tage bei 4, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 45 und 60 °C bestimmt, wie von Goldberg et al.44 beschrieben. Der pH-Bereich für das Wachstum wurde in MB auf pH 4,0–8,0 unter Verwendung von Pufferphosphat/HCl Na2HPO4 0,1 M/NaH2PO4 0,1 M44 und auf pH 9,0–10,0 unter Verwendung von Puffer Na2CO3 0,1 M/NaHCO3 0,1 M79 eingestellt, jeweils in Abständen von 0,5 pH-Einheiten . Die Zellen der drei neuen Stämme wurden in gepuffertem MB kultiviert, mit der Membran Millex® VV 0,1 µm sterilisiert und bei 30 °C gemäß Goldberg et al.44 inkubiert. Unter Bezugnahme auf Jung et al.43 wurde die Kochsalztoleranz am ergänzenden MB bestimmt, die mit verschiedenen Konzentrationen von NaCl (0, 0,5 und 1,0–16,0 % (Gew./Vol.) in Schritten von 1,0 %) bei 30 °C überwacht wurde , pH 7,044. Um den Sauerstoffbedarf zu ermitteln, wurden die drei neuen Stämme auf MA-Platten kultiviert und unter aeroben, mikroaerophilen (in einem geschlossenen Gefäß mit einer Packung BD GasPak EZ CO2-Behältersystem) und anaeroben Bedingungen (in einem geschlossenen Gefäß mit einer Packung BD GasPak EZ CO2-Behältersystem) inkubiert BD GasPak EZ Anaerobbehältersystem) für eine Woche bei 28 °C. Zur Beurteilung der Pigmente vom Flexirubin-Typ wurden Tropfen einer 20 %igen KOH-Lösung auf die Oberfläche der Kolonien gegeben und die positiven und negativen Ergebnisse anhand der sich ändernden Farbe der Kolonien überwacht, wie in80 beschrieben. Die Gleitaktivität wurde mit der Methode des hängenden Tropfens getestet, wie von Bowman81 beschrieben.

Zur Identifizierung der biochemischen Eigenschaften wurden Zellen der drei neuen Isolate und ihrer Referenzstämme verwendet, die zwei Tage lang bei 30 °C auf MA kultiviert wurden. Die Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers parallel auf API ZYM, API 20NE (bioMerieux) und GEN III MicroPlates (Biolog) inokuliert, mit der Ausnahme, dass die Kochsalzlösung in den Impfflüssigkeiten für eine Endkonzentration von 2 % (w/m) enthalten war. v)44. Die Hydrolyse von Stärke wurde auf MA mit zugeführter 0,2 % (Gew./Vol.) Stärke getestet und durch eine klare Zone nach dem Anfärben mit Jodlösung nachgewiesen82. Die Hydrolyse von Cellulose wurde auf einer CMC-Agarplatte beurteilt (in 1 L: 1 g NH4H2PO4, 0,2 g KCl, 1 g MgSO4.7H2O, 1 g Hefeextrakt, 26 g Carboxymethylcellulose-Natriumsalz, 20 g NaCl, 15 g Agar, in 1). L künstliches Meerwasser83) und nach Einbettung in Kongorot und Waschen mit 1 %iger NaCl-Lösung durch eine klare Zone nachgewiesen. Die Chitin-abbauende Aktivität wurde auf einem Minimalsalzmedium untersucht (in 1 L: 0,5 g KH2PO4, 1,5 g K2HPO4, 1 g NH4NO3, 20 g NaCl, 1 mg Hefeextrakt, 0,5 g Chitin, pH 7,0, 20 g Agar, destilliertes Wasser). 1000 ml) nach Xu et al.84 für sieben Tage bei 30 °C. Die Hydrolyse der Tweens 20, 40 und 80 (1 %, v/v) wurde unter Verwendung von MA als Basismedium bestimmt79,85. Die H2S-Produktion wurde auf MB getestet, das mit 5 g/L Natriumthiosulfat versorgt wurde, und mithilfe eines mit Bleiacetat imprägnierten Filterpapierstreifens nachgewiesen79,85. Um die Katalaseaktivität zu bestimmen, wurde 3%ige H2O2-Lösung auf die Oberfläche der Zellen getropft82. Die Oxidaseaktivität wurde durch die Reaktion der Zellen auf das Oxidasereagenz (bioMerieux) getestet. Die DNase-Aktivität wurde auf DNase-Agar (Difco) unter Verwendung von künstlichem Meerwasser83 mit 2 % NaCl anstelle von destilliertem Wasser untersucht. Die Gelatinase-Aktivität wurde an Nährgelatine (Remel-Gelatine-Medium), in dem destilliertes Wasser durch künstliches Meerwasser83 mit 2 % NaCl ersetzt wurde, eine Woche lang bei 25 °C getestet, und ein positives Ergebnis wurde durch das Vorhandensein eines Mediums im flüssigen Zustand erkannt82.

Chemotaxonomische Merkmale von SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T wurden bestimmt. Für das Fettsäureprofil der drei neuen Isolate und ihrer Referenzstämme wurden zwei Tage lang auf MA kultivierte Zellen geerntet. Zur Extraktion der Fettsäurekomponenten wurde das Standard-MIDI-Protokoll86 (Version 6.2) verwendet. Die extrahierten Fettsäuremethylester wurden dann in einen Gaschromatographen86 injiziert und die Komponenten wurden anhand der TSBA 6.0-Datenbank87 identifiziert. Die Chinontypen SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T wurden aus 100 mg gefriergetrockneten Zellen jedes Stamms durch Schütteln in Chloroform-Methanol (2:1, Vol./Vol.) über Nacht extrahiert. Die Extrakte wurden konzentriert und in 100 % Aceton erneut gelöst. Die Acetonsuspension wurde einer Dünnschichtchromatographie (TLC, Kieselgel 60F254, 20 × 20 cm, Merck) unterzogen und in einem kombinierten Lösungsmittel aus Petrolether-Diethylether (9:1, Vol./Vol.) aufgetrennt. Die unter UV-Licht nachgewiesene Bande wurde markiert, geerntet und in Aceton gewonnen. Die Extrakte wurden mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (LC20AD-System, Shimadzu) unter Verwendung einer ODS-2 (C18)-Säule (150 × 4,6 mm ID; YMC HPLC-Säule) mit einer Kombination aus Methanol-Isopropylether ( 3:1, v/v) als mobile Phase und Wellenlänge von 270 nm zum Nachweis der Chinonkomponenten87. Die polaren Lipide der drei neuen Stämme wurden aus ihren gefriergetrockneten Zellen nach der detaillierten Methode von Komagata und Suzuki88 extrahiert. Extrahierte Lipide wurden auf ein Viertel einer Kieselgel-DC-Platte aufgetragen und die erste Dimension wurde in kombinierten Lösungsmitteln aus Chloroform-Methanol-Wasser (65:25:4, Vol./Vol./Vol.) entwickelt, und anschließend wurde die zweite Dimension entwickelt in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform–Methanol-Essigsäure–Wasser (80:15:12:4, v/v/v/v)87. Die TLC-Platten wurden mit verschiedenen geeigneten Reagenzien besprüht, um die polaren Lipidprofile der neuen Isolate zu identifizieren, darunter Molybdatophosphorsäure zur Identifizierung der Gesamtlipide, Ninhydrin für die Aminogruppen, Molybdänblau für Phosphatgruppen und α-Naphthol in einer Schwefelsäurelösung die Zuckergruppen erkennen89.

Genomische DNA der Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T wurde aus einer zweitägigen Kultur auf einer MA-Platte mit einem NucleoSpin Microbial DNA Kit (MACHEREY-NAGEL, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Qualität der genomischen DNA wurde mit Nanodrop 2000/2000c quantifiziert und die Größenlänge wurde auf einem 1 %igen Agarosegel-Elektrophoresegel überwacht.

Die Gesamtgenomsequenzen der drei neuartigen Isolate wurden durch die Kombination zweier Plattformmethoden bestimmt, der Illumina-Plattform (bei Macrogen, Inc., Seoul, Republik Korea) und der Nanopore-Plattform (im Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience). und Biotechnologie, Republik Korea). Für die Illumina-Sequenzierung wurde die kurze DNA verwendet, um eine Bibliothek basierend auf dem Protokoll des TruSeq DNA PCR-Free-Probenvorbereitungshandbuchs, Teilenummer 15036187 Rev. D, aufzubauen. Für die Nanoporensequenzierung wurde die hochmolekulare DNA verwendet um die Bibliothek gemäß dem Native Barcoding Genomic DNA Protocol (mit EXP-NBD104 und SGK-LSK109, Version NBE_9065_v109_revV_14Aug2019) vorzubereiten. Die Genome wurden von Canu de novo zusammengesetzt (Version 2)90. Medaka (Version 1.3.2, https://github.com/nanoporetech/medaka) wurde als Polierwerkzeug für den Zusammenbau verwendet, indem das Vorkommen jedes Nukleotids an jeder Position in der zusammengesetzten Sequenz gezählt wurde, um die wahre Base an dieser Position vorherzusagen. Die Qualität der zusammengestellten Genome und die Vollständigkeit der Annotation wurden auf BUSCO (https://busco.ezlab.org/)91 quantifiziert. Die Kontamination und die Vollständigkeit der Genome wurden mit CheckM (Version 1.1.3)92 geschätzt. Genome wurden auf Prokka (Version 1.12)93 annotiert. Die digitale DNA-DNA-Hybridisierung wurde mit dem ANI-Tool (Average Nucleotide Identity) auf EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)46 und dem Genom-zu-Genom-Abstandsrechner (Version 2.1) auf DSMZ berechnet ( https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php#)47. Aus der gesamten Genomsequenz wurde der G + C-Gehalt berechnet. Die aus der Prokka-Pipeline erhaltenen Gensequenzen wurden mit der COG-Datenbank94 unter Verwendung von RPS-BLAST95 (e-value = \({10}^{-4}\)) annotiert, das in WebMGA integriert ist (https://github.com/weizhongli/ webMGA)96. Kohlenhydrataktive Enzyme wurden mithilfe des dbCAN2-Metaservers50 und der CAZy-Datenbank97 annotiert. Biosynthetische Gencluster (BGCs) wurden von antiSMASH 6.048 vorhergesagt.

Der auf dem gesamten Genom basierende phylogenetische Baum wurde auf der aktuellen Pipeline der bakteriellen Kerngene (UBCG) mit 92 Kerngenen erstellt98. Flavobacterium aquatile ATCC 11947T (GCF_002217235) als Fremdgruppe.

Um die Aktivität polysaccharidabbauender Enzyme zu testen, wurde das flüssige Medium durch Zugabe der folgenden Polysaccharidsubstrate zur Meeresbrühe hergestellt: κ-Carrageenan, Cellulose, Chitin, Natriumalginat, Stärke und Xylan 0,2 % (w/v); Fucoidan und Laminarin 0,1 % (w/v)99. Die am zweiten Tag auf MA-Platten geernteten Zellen wurden beimpft. Die anfängliche Zellkonzentration wurde auf OD600nm 0,2 eingestellt. Die Negativkontrolle war das Kulturmedium ohne Bakterienzellen. Nach drei Tagen wurde der Überstand der Kultur geerntet und mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)100 umgesetzt, um eine reduzierende Zuckerproduktion festzustellen. Kurz gesagt, der Überstand wurde mit DNS-Reagenz (1:3, Vol./Vol.) in einem Glasreagenzglas umgesetzt und das Röhrchen dann 5 Minuten lang in einem Bad mit kochendem Wasser erhitzt. Die Röhrchen wurden unter Leitungswasser gekühlt. Die Absorption bei 570 nm wurde gemessen, um etwaigen reduzierenden Zucker nachzuweisen, der beim Abbau von Polysacchariden freigesetzt wird100.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind im NCBI-Repository verfügbar. Die GenBank-Zugangsnummern der 16S-rRNA-Gensequenzen der Stämme SS9-22T, W9P-11T und SW1-E11T lauten OM403091, OM403093 bzw. OM403092. Die GenBank-Sequenznummern lauten CP089981, CP089979 bzw. CP089980.

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Die Autoren danken Prof. Dr. Bernhard Schink von der Universität Konstanz (Deutschland) für seine Hilfe bei der Nomenklatur von drei neuartigen Arten. Das Forschungsinitiativeprogramm des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) (KGM5232322) und der von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierte Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (Nr. NRF-2021M3H9A1030164) unterstützten diese Forschung.

Biological Resource Center, Koreanische Sammlung für Typuskulturen, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Jeongeup, 56212, Republik Korea

Tra TH Nguyen, Zhun Li, Yong-Jae Lee, Jaeho Ko und Song-Gun Kim

Abteilung für Biotechnologie, KRIBB School, Universität für Wissenschaft und Technologie (UST), Daejeon, 34113, Republik Korea

Tra TH Nguyen, Zhun Li und Song-Gun Kim

Hanoi University of Science, Vietnam National University, Hanoi, 10000, Vietnam

Tien Q. Vuong

Die Universität Danang, Universität für Wissenschaft und Technologie, 54 Nguyen Luong Bang St., Da Nang, 550000, Vietnam

Ho Le Han

GB Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry der Fernöstlichen Abteilung der Russischen Akademie der Wissenschaften, Wladiwostok, Russland, 690022

Olga I. Nedashkovskaya

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TTHN führte die Experimente einschließlich Probenentnahme, Isolierung und Charakterisierung von Bakterien durch, analysierte die Genome auf Polysaccharidabbau und verfasste das Manuskript. TQV analysierte Genome, erstellte einen UBGC-Genombaum und schrieb eine Methode zur Genomanalyse. HLH bestimmte die phänotypischen und biochemischen Eigenschaften von Bakterien und schrieb Methoden für diese Teile. ZL hat REM-Bilder gemacht. YL und JK fügten die Genome der Stämme zusammen. OIN hat das Manuskript fertiggestellt. SG.K. überwachte alle Experimente und stellte das Manuskript fertig. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Song-Gun Kim.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nguyen, TTH, Vuong, TQ, Han, HL et al. Drei Meeresarten der Gattung Fulvivirga, reichhaltige Quellen für kohlenhydrataktive Enzyme, die Alginat, Chitin, Laminarin, Stärke und Xylan abbauen. Sci Rep 13, 6301 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33408-4

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Eingegangen: 11. Oktober 2022

Angenommen: 12. April 2023

Veröffentlicht: 18. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33408-4

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